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轉(zhuǎn)基因玉米熒光現(xiàn)場可視化檢測方法

更新時間:2022-05-11   點擊次數(shù):1187次

  近日,浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)表文獻(xiàn),利用LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源轉(zhuǎn)基因玉米雙抗的可視化檢測。文獻(xiàn)摘要如下:

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 具有良好的抗蟲性和除草劑耐受性,是我國批獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因 玉米之一,具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究利用重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)建立轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的現(xiàn)場快速檢測方法。

針對轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的轉(zhuǎn) 化體特異性序列片段,設(shè)計引物和探針,通過引物篩選實驗得到更佳引物與探針組合。熒光 RPA 擴增 結(jié)果可以在藍(lán)光(LUYOR-3415RG)下直接進(jìn)行可視化分析。結(jié)果表明,建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 可視化檢測體系特異 性強,檢測靈敏度達(dá)到 10 拷貝。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) RPA 的擴增體系對溫度有很強的適應(yīng)性,樣品在 34℃ ~46℃之間都能得到擴增,據(jù)此,本研究利用市面上常見的自發(fā)熱暖貼代替常規(guī)的加熱儀器來激發(fā) RPA。 結(jié)果表明,自發(fā)熱暖貼滿足 RPA 擴增體系對溫度的需要。

最終,本研究將自發(fā)熱暖貼加熱法與 RPA 可 視化檢測體系結(jié)合,對轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 進(jìn)行現(xiàn)場檢測,并與 qPCR 方法檢測結(jié)果作比較,檢測結(jié)果表明,本研究建立的現(xiàn)場可視化檢測方法與 qPCR 方法檢測結(jié)果一致,并且可視化檢測方法時間短, 檢測結(jié)果清晰易分辨。本研究建立的轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 現(xiàn)場快速可視化檢測方法,其特異性強、靈敏度高、方便、快捷,不僅滿足了轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5的現(xiàn)場快速檢測的需要,也為其他現(xiàn)場快速檢測方法的開發(fā)提供了新思路。


1 材料與方法 

1.1 材料 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 種子,轉(zhuǎn)基因玉米 NK603、BT176、T25 和 BT11,轉(zhuǎn)基因大豆 A5547-127、356043、GTS40-3-2 和 FG72,轉(zhuǎn)基因油菜 MS1×RF1、MS2×RF2、MS8×RF3 和 OXY235,轉(zhuǎn)基因棉花 LLcotton25、MON15985 和 GHB119 的 DNA 均來自本實驗室。 

1.2 DNA 提取 按照植物 DNA 提取試劑盒(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)說明書提取各樣品的基 因組 DNA,所提取的 DNA 用核酸蛋白測定儀 NanoDrop2000C(美國 Thermo 公司)進(jìn)行核 酸質(zhì)量分析,并置于-20℃貯存?zhèn)溆谩?nbsp;

1.3 熒光 RPA 參照 RPA(熒光型)試劑盒(濰坊安普未來生物科技有限公司)說明書進(jìn)行體系配置, 熒光 RPA 反應(yīng)體系為 50 μL:Buffer A 12.5 μL,10 μmol/L 正、反向引物各 2 μL,10 μmol/L 探針 0.6 μL,模板 DNA 2 μL,加 ddH2O 補齊到 47.5 μL,充分混勻后加入 Buffer B 2.5 μL, 再次混勻。熒光 RPA 反應(yīng)條件:39℃擴增 20 min。熒光 RPA 的實時熒光信號用熒光定量 PCR 儀 CFX96(美國伯樂公司)觀察,熒光 RPA 的可視化結(jié)果用手持藍(lán)光燈(LUYOR-3415RG,路陽儀器)照射并在黃色濾鏡下拍照觀察。 

1.4 引物與探針設(shè)計 熒光 RPA 體系包括 2 條引物和 1 條探針,轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的載體示意圖及擴增的 轉(zhuǎn)化體特異性序列信息見圖 1A。利用 Vector NTI 軟件在外源插入位點的左側(cè)即轉(zhuǎn)基因玉米 基因組序列設(shè)計上游引物 8 條,在外源插入位點的右側(cè)即外源插入片段序列設(shè)計下游引物 8 條。所設(shè)計的上、下游引物分別處于外源插入位點的兩側(cè),以保證對轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的 特異性擴增。引物長度 30~35 bp,GC 含量占 30%~70%[13]。所設(shè)計探針包含玉米基因組和 外源片段的序列,長度 46~52 bp,并避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)重復(fù)堿基。探針共 有 4 個修飾位點,在距離 5'端中間部位,第 31 個堿基 G 處標(biāo)記一個四氫呋喃(THF)堿基 類似物,作為核酸外切酶的識別位點;在 THF 位點的上游,第 30 個堿基 T 處標(biāo)記一個熒光 基團(FAM:6-羧基熒光素),在 THF 位點的下游,第 33 個堿基 T 處標(biāo)記一個淬滅基團(BHQ: 熒光猝滅基團),兩基團的間距為 1~5 bp;THF 位點距離 3'末端至少 15 bp 長度,并在 3'末 端標(biāo)記一個修飾基團。只有當(dāng)探針與序列成功配對時,THF 位點才會被外切酶切割,使熒光 基團與淬滅基團分離,從而產(chǎn)生熒光信號(圖 1B)。 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 的普通 PCR 引物和 qPCR 引物引用標(biāo)準(zhǔn)[14],本研究所用的引 物和探針配制為 10 μmol/L。所有引物和探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 引物和探針信息見表 1。 

1.5 引物篩查 用上游引物 F1 分別與所有下游引物組合,結(jié)合探針,對轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 進(jìn)行實時 熒光 RPA 檢測實驗,分析結(jié)果,選出其中擴增效率更高的下游引物,再用這條下游引物分 別與所有上游引物組合,結(jié)合探針,對轉(zhuǎn)基因玉米雙抗 12-5 進(jìn)行實時熒光 RPA 檢測實驗, 選擇擴增效率更高的一組,作為最終的檢測引物組合。

RRC平臺實樣現(xiàn)場檢測

為評估RRC平臺在真實樣品現(xiàn)場檢測中的適用性,以96顆大豆的96片葉片作為真實樣品。一個簡短的工作流程展示在圖 3A. 所有 DNA 均通過 RDEM 提取,并用作 RT-PCR 和 RAA 的模板。RRC平臺的視覺熒光結(jié)果表明,從96個樣品中檢測到22個SHZD32-1。帶有SHZD32-1的試管中呈現(xiàn)亮綠色熒光。因此很容易與其他沒有 SHZD32-1 的管區(qū)分開來(圖 1B)。此外,使用熒光成像系統(tǒng)(ChemiDoc Imaging System,Bio-Rad,美國)分析 RRC 平臺的 96 孔板。在這些管中觀察到白色熒光(圖 1B)。這一結(jié)果意味著手持熒光燈(LUYOR-3415RG)的可視化結(jié)果可以與大型專業(yè)儀器的觀察結(jié)果相媲美。此外,RRC平臺和RT-PCR的現(xiàn)場檢測結(jié)果一致。96份樣本經(jīng)RT-PCR檢測,同樣22份樣本為SHZD32-1,22份樣本的Ct值與擴增曲線一起給出(圖 1C)。這些發(fā)現(xiàn)表明,RRC 平臺對于目標(biāo)核酸的現(xiàn)場檢測具有高度的準(zhǔn)確性。

文獻(xiàn)全文下載地址:

Frontiers | A Fast, Visual, and Instrument-free Platform Involving Rapid DNA Extraction, Chemical Heating, and Recombinase Aided Amplification for On-Site Nucleic Acid Detection | Bioengineering and Biotechnology (frontiersin.org)

LUYOR-3415RG便攜式熒光蛋白激發(fā)光源產(chǎn)品介紹:


上海路陽儀器有限公司

上海路陽儀器有限公司

地址:上海市松江區(qū)新橋鎮(zhèn)泗磚南路255弄120號

主營產(chǎn)品:黑光燈,探傷燈,紫外線探傷燈,LED磁粉探傷燈,熒光檢漏燈,熒光檢漏劑,檢漏手電筒,脫脂檢測燈

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