>雖然許多藥物和日化用品對(duì)人體不會(huì)造成直接的傷害,但在紫外線的作用下,例如日光照射、紫外環(huán)境下操作條件下便會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),從而引發(fā)皮膚過敏癥或者其他形式的傷害,專業(yè)上稱之為化學(xué)品具有的光毒性傷害。對(duì)此類化學(xué)制品進(jìn)行光毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可以預(yù)防和減輕這類光毒性給我們帶來的不利影響。
LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀克服了現(xiàn)有的光毒性鑒定實(shí)驗(yàn)設(shè)施所用的光源不純, 實(shí)驗(yàn)效率低下,而且實(shí)驗(yàn)條件惡劣,操作人員不安全。LUYOR-3450可以準(zhǔn)確控制實(shí)驗(yàn)精度、安全、方便、高效的紫外輻照儀。
本試驗(yàn)方法通過測(cè)定3T3成纖維細(xì)胞經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和紫外線照射聯(lián)合作用后細(xì)胞吸收中性紅的能力或細(xì)胞毒性的變化來判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光毒性。光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長(zhǎng),推薦使用LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀.
細(xì)胞光毒性是指應(yīng)用于機(jī)體的物質(zhì)經(jīng)暴露于光線后誘發(fā)或增強(qiáng)(在低劑量水平時(shí)明顯)的毒性反應(yīng),或全身應(yīng)用一種物質(zhì)后由皮膚光照引起的反應(yīng)。中性紅是一種弱的陽離子染料,極易以非離子擴(kuò)散的方式穿透細(xì)胞膜并在細(xì)胞溶酶體內(nèi)聚集。某些化學(xué)物質(zhì)和外界條件作用可引起細(xì)胞表面或溶酶體膜敏感性的改變導(dǎo)致溶酶體脆性增高等不可逆的細(xì)胞毒性變化,從而導(dǎo)致細(xì)胞吸收中性紅的能力下降。
本試驗(yàn)方法通過測(cè)定3T3成纖維細(xì)胞經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和紫外線照射聯(lián)合作用后細(xì)胞吸收中性紅的能力或細(xì)胞毒性的變化來判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光毒性。
(一)光源類型
選擇合適的光源必須符合的標(biāo)準(zhǔn)包括:光源發(fā)射的光波長(zhǎng)能被受試物吸收(吸收光譜),光的劑量(在一個(gè)合理的暴露時(shí)間內(nèi)能達(dá)到的劑量)能滿足已知光毒性化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)。此外的波長(zhǎng)和劑量不能有損于試驗(yàn)系統(tǒng),如(紅外區(qū)域)熱量散發(fā)或類似UVB波長(zhǎng)的高細(xì)胞毒性的干擾,因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長(zhǎng),推薦使用LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀。
由于的太陽光模擬器都發(fā)射出相當(dāng)數(shù)量的UVB,應(yīng)經(jīng)過適當(dāng)?shù)倪^濾使UVB<0.1J/cm2。透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強(qiáng)度建議為1.7mW/cm2光強(qiáng)度(即5J/cm2)劑量。
(二)細(xì)胞株
選用永生化小鼠成纖維細(xì)胞系—Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞。要求細(xì)胞來源必須是具有公信力的機(jī)構(gòu)且能確保細(xì)胞品質(zhì)穩(wěn)定。
由于細(xì)胞對(duì)UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高,建議用于試驗(yàn)的Balb/c 3T3成纖維細(xì)胞傳代次數(shù)好少于100次。
測(cè)試單位若自行培養(yǎng)細(xì)胞株,則須定期檢測(cè)細(xì)胞株對(duì)UV光的敏感性,并確保無支原體污染。
(三)培養(yǎng)基
采用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清(10%)、谷氨酰胺(4mmol/L)、抗生素(青霉素和鏈霉素,濃度分別為100IU和100μg/mL),在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養(yǎng)。
(四)溶劑的選擇
在測(cè)定前,應(yīng)首先評(píng)價(jià)受試物的溶解度,以選擇佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),不影響細(xì)胞活性。
能溶于水且濃度達(dá)1000μg/mL的受試物可溶于預(yù)先加溫(37℃)和滅菌的磷酸鹽緩沖液(EBSS或PBS)。水中溶解度有限的受試物(<1000μg/mL)可用二甲基亞砜(DMSO)或乙醇(ETOH)等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時(shí),其終濃度不得超過總體積的1%(v/v),陰性對(duì)照組和受試物組溶劑的體積比例應(yīng)相同。
(五)受試物的配制
受試物必須在使用前新鮮配制。建議的化學(xué)物質(zhì)操作和細(xì)胞處理初期都應(yīng)避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進(jìn)行。
每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)空白對(duì)照、溶劑對(duì)照和陽性對(duì)照。加樣示意圖見附錄B。
(六)受試物劑量的設(shè)置
需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子(如 =3.16)稀釋成8個(gè)濃度,相關(guān)濃度范圍應(yīng)包括從大細(xì)胞毒性至幾乎無細(xì)胞毒性濃度(細(xì)胞存活率在20%—的范圍)。
如果預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在濃度等于1000μg/mL時(shí)仍未出現(xiàn)細(xì)胞毒性,則建議高濃度為1000μg/mL;若出現(xiàn)細(xì)胞毒性的濃度低于1000μg/mL時(shí),有細(xì)胞毒性的濃度少于三種,則需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)或使用更小的稀釋因子,直至出現(xiàn)有細(xì)胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度,高濃度不能達(dá)到1000μg/mL,則以大溶解度時(shí)的濃度作為高濃度,避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。
如果在無光照條件下(-Irr)受試物在高濃度時(shí)仍然不具有細(xì)胞毒性,而在有光照條件下(+Irr)出現(xiàn)強(qiáng)烈細(xì)胞毒性,則在-Irr試驗(yàn)和+Irr試驗(yàn)中可采用不同的試驗(yàn)濃度。
(七)中性紅(Neutral Red,NR)
化學(xué)名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride),CAS編號(hào):553-24-2;或藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),編號(hào):100460。
(八)中性紅溶液
1.中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料,溶于100mL蒸餾水(室溫條件下可保存2個(gè)月)
2.中性紅使用液。在79mL DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液,即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。
(九)中性紅解吸附溶液
將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制(現(xiàn)用現(xiàn)配,儲(chǔ)存不超過1小時(shí))。
(一)加100μL培養(yǎng)基于96孔組織培養(yǎng)板的外圍孔(空白對(duì)照),在其余孔中加入100μL密度為1×105個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液(即1×104細(xì)胞/孔)。每次試驗(yàn)制備兩個(gè)板,包括相同的受試物濃度系列、溶劑對(duì)照、空白對(duì)照和陽性對(duì)照,一個(gè)板用于確定細(xì)胞毒性(-Irr),另一個(gè)板用于確定光毒性(+Irr)。
(二)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)(5%—7.5%CO2,37℃)直至它們形成單層半飽和細(xì)胞。該培養(yǎng)過程允許細(xì)胞恢復(fù)和粘連。
(三)去除培養(yǎng)液,用150μL EBSS或PBS輕柔沖洗細(xì)胞一次或兩次。加入100μL含適當(dāng)濃度受試物或溶劑的緩沖液到孔中。培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)(5%—7.5%CO2,37℃)。
(四)在室溫下將其中一個(gè)板放入LUYOR-3450細(xì)胞光毒性輻照儀的輻照腔內(nèi)進(jìn)行光照(+Irr)暴露,以1.7mW/cm2光強(qiáng)度透過96孔板蓋照射細(xì)胞50分鐘;同時(shí)將另一個(gè)平板無光照(-Irr)置于暗盒內(nèi)50分鐘。
(五)去除受試溶液,用150μL EBSS或PBS仔細(xì)沖洗細(xì)胞兩次。加入100μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)過夜(18—22小時(shí),5%—7.5%CO2,37℃)。
(六)在相差顯微鏡下檢查細(xì)胞,記錄受試物細(xì)胞毒性所致細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變,用于排除試驗(yàn)誤差。
(七)中性紅吸收(NRU)測(cè)量。細(xì)胞吸收中性紅進(jìn)入溶酶體和活細(xì)胞體內(nèi)空泡,可用作細(xì)胞數(shù)量和活性的定量指標(biāo)。
1.用150μL預(yù)溫的EBSS或PBS沖洗細(xì)胞一次或兩次。輕柔拍打平板,去除沖洗溶液。加入100μL含50μg/mL中性紅的培養(yǎng)液,在5%—7.5%CO2,37℃和濕度適宜的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞3小時(shí)。
2.去除中性紅培養(yǎng)液,用150μL EBSS或PBS沖洗細(xì)胞一次或兩次。
3.輕輕倒出并吸干全部EBSS或PBS。
4.準(zhǔn)確加入150μL中性紅解吸附溶液。
5.在微量滴定平板振蕩器上震蕩96孔板10分鐘,直至中性紅從細(xì)胞內(nèi)被提取出來,并形成均勻溶液。
6.用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定中性紅提取物溶液在540nm波長(zhǎng)處的光密度。用空白孔作為參考對(duì)照。
七、結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)
(一)確定以光刺激因子(PIF值)為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型
1.通過分析在有光照(+Irr)和無光照(-Irr)兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線,確定能抑制50%細(xì)胞活性的受試物濃度(IC50),按下列公式計(jì)算光刺激因子(PIF)。
PIF=IC50(-Irr)
IC50(+Irr)
評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):PIF≤2:預(yù)測(cè)“無光毒性";PIF≥5:預(yù)測(cè)“有光毒性"。PIF介于2—5之間,需進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn);如果PIF仍介于2—5之間,預(yù)測(cè)“有潛在光毒性"。
2.如果受試物在有光照(+Irr)時(shí)有細(xì)胞毒性,無光照(-Irr)時(shí)無細(xì)胞毒性,且細(xì)胞毒性試驗(yàn)所使用的濃度已達(dá)高受試濃度(Cmax)時(shí),可按照下列公式計(jì)算>PIF:
>PIF=Cmax(-Irr)/ IC50(+Irr)
評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為:如果只獲得一個(gè)“>PIF",那么任何>PIF >1的值都能提示“有潛在光毒性"。
3.受試物在高濃度時(shí)仍未顯示任何細(xì)胞毒性,用“PIF=*1"表示,提示“無潛在光毒性"。
(二)確定以平均光效應(yīng)(MPE值)為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型
通過在濃度網(wǎng)格上比較有光照(+Irr)和無光照(-Irr)兩種情況下獲得的細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線(i=1,….,N)可得到平均光效應(yīng)(MPE),細(xì)胞毒性濃度反應(yīng)曲線的染毒濃度需在有光照(+Irr)和無光照(-Irr)試驗(yàn)共有的濃度范圍內(nèi)選擇。濃度Ci的光效應(yīng)(PEi)等于濃度效應(yīng)(CEi)和反應(yīng)效應(yīng)(REi)的乘積。使用專門的軟件“PHOTO32或更高版本"求得平均光效應(yīng)(MPE),建立以平均光效應(yīng)(MPE)為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型。通過將MPE與臨界閾值MPEc比較,預(yù)測(cè)化學(xué)物潛在光毒性的預(yù)測(cè)模型。
閾值MPEc=0.1
評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):
如果MPE≤0.1:預(yù)測(cè)無潛在光毒性;
如果MPE≥0.15:預(yù)測(cè)有潛在光毒性。
如果MPE介于0.1—0.15之間,需進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn);如果MPE仍介于0.1—0.15之間,預(yù)測(cè)有潛在光毒性。
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