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紫外交聯(lián)儀用于Southern印跡雜交

更新時(shí)間:2023-04-19   點(diǎn)擊次數(shù):844次

紫外交聯(lián)儀用于Southern印跡雜交

Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是:具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下,可按堿基互補(bǔ)的原則特異性地雜交形成雙鏈。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA片段,將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上,經(jīng)干烤或者紫外交聯(lián)儀的紫外線照射固定,再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交,用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色,從而檢測(cè)特定DNA分子的含量  。

由于核酸分子的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性,綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果,便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖,或進(jìn)行目的基因序列的測(cè)定以滿(mǎn)足基因克隆的特殊要求,還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類(lèi)數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得。

Southern印跡雜交技術(shù)包括兩個(gè)主要過(guò)程:一是將待測(cè)定核酸分子通過(guò)一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物(硝酸纖維素膜或尼龍膜)上,即印跡(blotting);二是固定于膜上的核酸與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火,即分子雜交過(guò)程。該技術(shù)是1975年英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的E.M.Southern的,Southern印跡雜交故因此而得名。早期的Southern印跡是將凝膠中的DNA變性后,經(jīng)毛細(xì)管的虹吸作用,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。印跡方法如電轉(zhuǎn)法、真空轉(zhuǎn)移法;濾膜發(fā)展了尼龍膜、化學(xué)活化膜(如APT、ABM纖維素膜)等。利用Southern印跡法可進(jìn)行克隆基因的酶切、圖譜分析、基因組中某一基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)等。

紫外交聯(lián)儀為什么有人稱(chēng)為DNA紫外交聯(lián)儀,核酸紫外交聯(lián)儀?

紫外交聯(lián)儀主要用于Northern和Southern印跡雜交實(shí)驗(yàn)中將DNA或RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜后固膜。

Northern印跡雜交(Northern blot)。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建,稱(chēng)為Southern印跡技術(shù),RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng),故被稱(chēng)為Northern印跡雜交,與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱(chēng)為Western blot。

Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA片段,將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上,經(jīng)干烤或者紫外線照射固定,再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交,用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色,從而檢測(cè)特定DNA分子的含量。

DNA是核酸的一種,核酸包括DNA和RNA。核酸的功效與作用是合成蛋白、維持機(jī)體免疫反應(yīng)和抗氧化,核酸是一種生物大分子,在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中既儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的作用,能夠維持機(jī)體正常的免疫反應(yīng),具有一定抗氧化的作用,還能夠促進(jìn)細(xì)胞的分化以及影響生物合成,又能夠促進(jìn)身體營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用。

斑點(diǎn)雜交(dot blot)是指將待測(cè)的DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜、NC膜)上,用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交,洗膜(除去未接合的探針),放射自顯影,判斷是否有雜交及其雜交強(qiáng)度,主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測(cè)。

狹縫斑點(diǎn)雜交(slot blot):也是廣義dot blot的一種。圓點(diǎn)的形狀因?yàn)辄c(diǎn)很小后期不利于光密度分析,并且孔不易清洗干凈。從點(diǎn)雜交角度來(lái)說(shuō),狹縫與斑點(diǎn)印跡沒(méi)有區(qū)別,只是終印跡形狀不同。如果覺(jué)得自己樣品量不大,擔(dān)心樣品不能填滿(mǎn)狹縫其實(shí)也不是問(wèn)題,因?yàn)椴惶顫M(mǎn)狹縫也不影響雜交結(jié)果,多是狹縫長(zhǎng)短不整齊,另外,通過(guò)稀釋樣品填滿(mǎn)狹縫以后再做雜交,后印跡雜交結(jié)果不受影響。

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