綠色熒光蛋白是一類(lèi)存在于腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。GFP具有多種優(yōu)點(diǎn):易于檢測(cè),靈敏度高;熒光性質(zhì)穩(wěn)定,耐受性強(qiáng);易于表達(dá),無(wú)細(xì)胞毒性;可用于活細(xì)胞檢測(cè)。
因此,GFP可作為報(bào)告基因用于檢測(cè)基因表達(dá)或調(diào)控,或作為融合標(biāo)簽來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)分子的定位、遷移、構(gòu)象變化以及分子間的相互作用,或者靶向標(biāo)記某些細(xì)胞器。
GFP吸收的光譜最大峰值為395nm(紫外),并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。
雖然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害更小,因此通常多使用該波段光源(多為488nm)。
此外,GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素強(qiáng),特別是在450~490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。
類(lèi)似的,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測(cè)定與分析。
由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類(lèi)報(bào)告蛋白無(wú)法比的。
但因?yàn)镚FP不是酶,熒光信號(hào)沒(méi)有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類(lèi)報(bào)告蛋白,比如螢火蟲(chóng)熒光素酶等。
觀察GFP熒光蛋白方法有:
采用熒光蛋白觀測(cè)燈是便捷、方便的觀察方法,因GFP在470nm有一個(gè)很高的吸收峰,采用 470nm激發(fā)光源能夠激發(fā)GFP發(fā)出明亮的綠色熒光,在觀察gfp熒光時(shí),因?yàn)榧ぐl(fā)光為強(qiáng)烈的藍(lán)色光線(xiàn),必須佩戴專(zhuān)業(yè)的觀察眼鏡才能觀察到清晰的熒光信號(hào)。
2. 紫外光源:
采用紫外光源(又叫紫外線(xiàn)燈、黑光燈)觀察也非常方便,但如果觀察植物,植物葉片的葉綠色在紫外線(xiàn)燈下也會(huì)發(fā)出熒光,對(duì)gfp發(fā)出的熒光也會(huì)產(chǎn)生干擾,另外,標(biāo)本長(zhǎng)時(shí)間在紫外光源照射下對(duì)GFP標(biāo)本組織也會(huì)造成破壞。
3.熒光顯微鏡
熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) : 熒光顯微鏡是以紫外線(xiàn)為光源, 用以照射被檢物體,使之發(fā)出熒光,然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。
熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì),如葉綠素等,受紫外線(xiàn)照射后可發(fā)熒光;
另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線(xiàn)照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡就是對(duì)這類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。
目前在常用的方法就是采用熒光顯微鏡觀察,熒光顯微鏡在實(shí)驗(yàn)室非常普及,但不足是必須采集葉片或動(dòng)物切片進(jìn)行觀察,對(duì)培養(yǎng)的標(biāo)本進(jìn)行破壞,無(wú)法進(jìn)行活體觀察。